Оплождане и развитие на ембриона в ин витро условия
Публикувано на: 05.10.2005г.

Оплождането е процес, който завършва със сливането на мъжкия и женския пронуклеус, водейки до образуване на нов индивид. За успешното реализиране на този процес са необходими:
1. Преминаване на сперматозоидите през cumulus oophorus;
2. Взаимодействие между сперматозоидите и zona pellucida;
3. Сливане между един сперматозоид и яйцеклетка;
4. Активиране на яйцеклетката;
5. Декондензация на ядрото на сперматозоида и образуване на мъжки пронуклеус;
6. Образуване на мъжки и женски пронуклеус и тяхното мигриране в центъра на яйцеклетката;
7. Образуване на делително вретено и началото на първото делене.

Яйцеклетките в метафаза II са заобиколени от кумулусни маси състоящи се от фоликуларни клетки разпръснати в полимеризиран междуклетъчен матрикс с основна съставка хиалуронова киселина. За да преминат успешно кумулуса сперматозоидите трябва да са капацитирани. Преди преминаването през zona pellucida, сперматозоидите трябва да се свържат с нея и да претърпят акрозомална реакция. Акрозомната реакция е екзоцитна и представлява многократно сливане между клетъчната плазмена мембрана на сперматозоида и външната акрозомална мембрана, в резултат на което се образуват хибридни везикули. Това води до изливане на акрозомалното съдържимо и преминаване на zona pellucida от оплождащия сперматозоид, който попада в перивителинното пространство и чрез своята главичка се слива с клетъчнат мембрана на яйцеклетката. Попаднал в цитоплазмата на яйцеклетката, оплождащия сперматозоид стартира серия от последователни процеси, известни като активация на яйцеклетката. Тези биохимични и морфологични процеси включват:

1. Промяна в потенциала на оволемата и рязко покачване на вътреклетъчната концентрация на калциеви йони, което морфологично води до екзоцитоза на кортикални гранули известна като кортикална реакция. Кортикалните гранули представляват хидролитични ензими, освободени в перивителинното пространство чрез екзоцитоза.

2. Тези ензими, попадайки в непосредствена близост със zona pellucida, променят нейните химични и физични свойства, което я прави непроницаема за други сперматозоиди. Нарушения в процеса на екзоцитоза на кортикални гранули може да доведе до пенетрация на повече от един сперматозоид в яйцеклетката – полиспермия. Това води до развитие на генетично абнормни ембриони. Поради това зиготи с повече от 2 пронуклеуса се унищожават в процеса на асистирана репродукция.

Основните морфологични моменти в клиничната ембриология следват определена хронологична последователност:

Нулев ден

В този ден се добиват и обработват половите клетки (гамети), а също така се извършва и инсеминацията на яйцеклетките чрез предварително капацитирани сперматозоиди или чрез ICSI.

Kапацитирани сперматозоиди
Незряла яйцеклетка в стадий GV-герминален везикул т.е ядрото на яйцеклетката на фона на тъмна, зърниста цитоплазма.
Незряла яйцеклетка в метафаза I (МI). това е фазата, чрез която яйцеклетката в стадий GV преминава в зряла яйцеклетка MII (метафаза II). MI яйцеклетката се характеризира с това, че не се визуализира както ядро, така и полярно телце (PB).
Зряла яйцеклетка в стадий MII (метафаза II). Морфологичният белег на този стадий е наличието на полярно телце (PB) в перивителинното пространство. Само яйцеклетки достигнали този стадий са годни за оплождане (инжектиране).

Първи ден

Образуване на зигота (оплодена яйцеклетка). При нормално протекло оплождане в центъра на цитоплазмата ясно се визуализрат два пронуклеуса, от които единият е мъжки (ядрото на сперматозоида), а другият е женски (ядрото на яйцеклетката), както и две полярни телца в перивителинното пространство.

Нормално оплодена яйцеклетка (зигота). В центъра на цитоплазмата се визуализират 2 пронуклеуса (2PN) с нуклеоли (малките черни точици) в тях. В перивиделинното пространство са разположени двете полярни телца (2PB). Нормално оплодената яйцеклетка се характеризира с 2PN и 2PB. Всяка друга комбинация се приема за абнормно оплождане.
3PN+1PB - ICSI ембрион
В този случай третият PN е в резултат от задържане на второто полярно телце.
3PN - IVF ембрион
В случаите на 3 PN + 2 PB - IVF ембрион третият пронуклеус е от втори проникнал в яйцеклетката сперматозоид. Тези ембриони са триплоидни.
1PN + 2 PB - ICSI ембрион

От втори до четвърти ден

Стадий на делене и формиране на бластомери (клетките на същинския ембрион). Първото митотично делене на зиготата е меридианно и води до образуване на два бластомера. Следващото делене на получените два бластомера е относително асинхронно и води до образуване на четири бластомера разположени под формата на кръст. На трети ден броят на бластомерите варира от пет до десет, а на четвърти ден поради увеличена контактна повърхност между бластомерите, границите им се заличават. Това е стадия морула, който е предвестник на образуването на бластоцистна кухина.

Ембрион в стадий два бластомера на втори ден след инсеминация
Четириклетъчен ембрион на втори ден след инсеминация. Бластомерите са с еднакви размери и липсват ацелуларни фрагменти в делителната кухина.
Перфектен десетклетъчен ембрион на трети ден след инсеминация.
Нормална морула на четвърти ден след инсеминация. Границите между бластомерите са заличени и трофоектодермалните клетки са оформени като периферни, плоски клетки.

От пети до седми ден

В този период се формира бластоциста, която се състои от два вида клетки:

1. Вътрешна клетъчна маса (ICM), от която се развива ембриобласта, т. е. същинския ембрион;
2. Трофоектодермални клетки тапициращи бластоцистната кухина и образуващи течност. От тези клетки се образуват екстраембрионалните структури на бременността: плацента, пъпна връв и околоплодни мембрани.

Трансферът на бластоциста улеснява селекцията на ембрионите с висок имплантационен потенциал, намалявайки необходимостта от трансфер на няколко ембриона, което от своя страна намалява риска от многоплодна бременност.

Бластоцистите се класифицират по тяхната морфология:

1. Ранна бластоциста – има малка бластоцистна кухина, заемаща под 50% от ембриона;
2. Разрастваща се бластоциста, която има голяма бластоцистна кухина с добре оформени трофектодерм и вътрешна клетъчна маса;
3. Напълно разрастнала се бластоциста. Обемът на бластоцистната кухина е нараснал значително (250-280 микрометра) и zona pellucida е силно изтъняла.

Последният важен процес преди имплантацията е излюпването на ембриона (hatching) – излизане на бластоциста от zona pellucida, което става на 5-7 ден от инсеминацията.

Експандиращ бластоцист на пети ден след инсеминация. Zona pellucida е силно изтънена и разкъсана от група трофоектодермални клетки. Визуализира се група клетки наречена вътрешна клетъчна маса (ICM), която представлява същинския ембрион (ембриобласт).
Две бластоцисти в процес на излюпване на пети ден след инсеминация. Левият бластоциsт е наполовина извън zona pellucida.
Напълно излюпен бластоцист на шести ден след инсеминация.
Напълно излюпен бластоцист, прогресивно увеличаващ размера си (сравни със zona pellucida)

 

Излюпен бластоцист на шест дни.

ICSI

ICSI (Intracytoplasmic sperm injection) представлява инжектиране на един сперматозоид директно в цитоплазмата на яйцеклетката, преминавайки с микроинжекционна пипета през zona pellucida и оволемата.
Тази техника на асистирана репродукция е насочена към лечение на мъжки стерилитет в резултат на увредена тестикуларна функция или обструкция на семепроводите, водещи до тежка олиго-астено-тератоспермия или дори до азооспермия.

1 2 3 4 5

1. ICSI процедура. Позиции на иглите и яйцеклетката преди въвеждане на иглата в яйцеклетката. На върха на иглата се вижда сперматозоида.
2. Въвеждане на ICSI иглата в яйеклетката.
3. Аспирация на оволемата до рязко потичане на цитозол в ICSI иглата, което е белег за руптура на оволемата. Следва внимателно инжектиране на сперматозоида в цитоплазмата.
4. Изваждане на ICSI иглата от яйцеклетката след инжектирането на сперматозоида.
5. Сперматозоид в средата на цитоплазмата, непосредствено след неговото инжектиране.



Безплодието в резултат на обструктивна азооспермия може успешно да се лекува чрез извличане на сперматозоиди от биопсична тестикуларна тъкан, наричано за кратко TESE (Testicular Sperm Extraction) и последващо ICSI. Чрез TESE-ICSI могат успешно да се лекуват и някои форми на необструктивна азооспермия.

Семиниферен тубул от тестикуларна биопсия.
Тестбопсия на тестикуларна тъкан, предхождаща същинската биопсия. Извършва се преди започване на ICSITESE и цели предварителното доказване на годни за ICSI сперматозоиди. Биопсия на тестикуларна тъкан. В центъра на снимката се виждат зрели тестикуларни сперматозоиди.

Асистирано излюпване на ембрион (аssisted hatching)

Тази процедура цели да улесни и гарантира излюпването на ембриона, чрез разкъсване на zona pellucida, посредством физични и химични методи. Асистираното излюпване е с противоречива стойност в кличничната ембриология. Все пак се счита, че е показана при пациентки над 40 годишма възраст и при наличие на няколко несполучливи IVF процедури.

Асистирано излюпване на (аssisted hatching) на ембрион с лошо качество. Асистирано излюпване на (аssisted hatching).




Автори: Д-р Кателия Александров и д-р Георги Козовски

Катедра “ Акушерство и гинекология “, МУ – Варна
СБАГАЛ-Варна-ЕООД, ВАРНА, БЪЛГАРИЯ
Бул. “ Цар Освободител “ 150
e-mail: Този имейл адрес е защитен от спам ботове. Трябва да имате пусната JavaScript поддръжка, за да го видите.